生物酶催化在工业合成中的应用

化学工业的发展为人类生活的改善和社会的进步提供了源源不断的物质基础和能源，与此同时也给环境带来了诸多的现实问题。生物酶催化技术是绿色工业可持续发展、环境友好的关键技术，也是绿色化学12 原则的发展方向之一，备受化工、环保和医药行业的推崇。生物酶催化技术与传统化学合成相比具有诸多优势，酶催化技术反应条件温和，能够有效缩短合成路线，提供更高的催化效率和立体选择性，实现低成本、低能耗、高质量的工业生产，避免了工业合成中有毒有害催化剂的使用，同时产生更少的副产物。生物酶催化技术作为绿色化学的重要组成部分，已经成为现代化学、生物学和制药学交叉领域里最活跃的研究热点之一。

1.生物酶应用分类

目前生物酶催化技术在工业小分子合成中的应用处于初期发展阶段。其现有工程技术领域的突破主要集中在基因工程和精细化工领域。通过基因工程和发酵工程获取的生物酶在催化转化适应性和稳定性上都得到了显著提升，在工业生产过程中降低能耗、提升反应收率、改善环境等方面具有非常重要的意义。目前常用的生物酶按照酶反应分类主要有氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和合成（连接）酶共计6 类。本文以最为常见的复合蛋白酶在手性药物不对称还原反应中的应用为例，简述生物酶催化技术在工业生产中的注意事项。

实验过程：采用4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的最适宜的反应条件；采用市售高活性干酵母（全细胞含有蛋白还原酶和NADP+辅酶）、分析纯葡萄糖20g/L(作为离子H+供体)、4-氯乙酰乙酸乙酯（市售工业品）为主反应原料。

在30℃恒温水浴锅中架设3000mL 的三口瓶，向三口瓶中加入400g 干酵母，投入80g 分析纯葡萄糖，加入1000mL一次蒸馏水，均匀搅拌至悬浮液中有大量气泡产生时（约10min），慢速滴加16mL 底物，继续搅拌，48h 后停止反应。反应结束后，向反应液中加入硅藻土，搅拌均匀后抽滤，滤液分3 次，每次600mL，萃取3 次以上，分出有机相，并用水洗滤渣3 次，再用乙酸乙酯萃取3 次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥。先蒸馏去除乙酸乙酯，之后继续减压蒸馏得到无色油状液体（bp93～95℃/5mmHg），即为成品。采用气质联用分析仪进行检测，所得成品为4-氯-R-3-羟基丁酸乙酯。

过程中采用了全细胞酶促反应，涉及到了影响化学反应的生物酶、辅酶、活性因子、浓度、温度、投料顺序、搅拌速率、溶剂，以及后期纯化提取中的萃取、干燥、蒸馏以及检测过程。在此过程中，任何一个因素都直接影响到工业设计和工业应用。

2.影响因素

实验过程采用的是生物酶不对称催化合成方法（catalytic chiral reaction）。本方法是指采用手性催化剂来控制不对称合成，在非手性底物（non-chiral substrate）进行不对称反应时，加入少量生物酶催化剂，使它与反应底物或试剂形成高反应活性的中间体，生物酶作为手性模板控制反应物的对映面，经不对称反应得到新的手性产物（chiral reaction product），这种转化过程具有高度立体、位点和区域选择性，产物单一，过程可调节控制。复合蛋白酶在工业生产手性药物不对称还原反应中，能够使分子内的酮基或者碳碳双键在生物酶的作用下立体选择性地还原并产生特定构型的化合物，即4-氯-R-3-羟基丁酸乙酯。现在生物手性还原多采用全细胞反应，突出优点是酶和辅酶在细胞环境内受到保护，辅酶循环由细胞自动完成，只需要加入少量碳源和活性因子即可。但有的生物酶还需要考虑固定化进行工业应用。下面从反应介质、活性因子、辅酶、固定化4个方面进行分析。

2.1 反应介质

常用的酶促反应介质（reaction medium）多数为水相，但手性催化合成过程中也有使用非水介质或两相介质的催化反应，比如乙醇介质、甲醇介质、乙醇-水介质、丙酮-水介质、甲苯-水介质等。在有机相-水介质中生物酶的结构和功能与在纯水相中有很大的不同，通过调整反应介质可以改善生物酶对目标反应的活性和选择性。其可能的原因在于：①不同生物酶具有不同的活性构象，三维构象对酶所处的反应环境要求不同，与反应物的亲水性和疏水性有很大的关系，直接影响酶的立体选择性；②体系中水含量的不同，能直接或者间接的通过氢键、疏水键、范德华力等非共价键相互作用来改变传质阻力，从而改变酶的催化性能；③反应介质影响酶蛋白结构的热力学稳定性，通过改变酶活性部位（活性中心）的极性，来改变分子上携带的电荷以及极性基团的相互作用；④水或有机溶剂直接参与（中间态）过程反应，影响反应平衡。因此在生物酶催化过程中注意有机溶剂的比例是控制生物酶最佳活性的关键。此过程在维持酶的催化活性前提下，可以通过不同比例的有机-水介质正交实验来验证。

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